Berbicara tentang HPLC (High Performance Liquid Chromathogrphy) sebagai instrument analisis pada artikel sebelumnya tidak bisa lepas dari bagian-bagiannya. Seperti kolom sebagai fasa diam pada HPLC.
Pernah lihat kan? Tidak seperti Gas Chromathography (GC), kolom pada HPLC dibuat lurus (tidak dibuat melingkar sebagaimana kolom pada Kromatografi Gas ataupun bentuk U). Hal ini dimaksudkan untuk efisiensi kolom.
Apa ya isi dari kolom HPLC itu?
Kolom terdiri dari fase diam (oktil, oktadesil, fenil, nitril, amin) yang terikat secara kimia dengan partikel silika berpori yang ada di bagian dalam kolom.
Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Fasa diam adalah cairan film yang dilapiskan pada material kemasan yang terdiri dari partikel silica berpori 3-10 .
Pada prakteknya, kolom sebagai fasa diam akan terus dialiri fasa gerak selama analisis berlangsung, apa kolom tersebut tidak terbawa oleh fasa gerak? hmmmm…
Fasa diam mungkin sebagian akan larut dalam fasa gerak. Untuk mencegah hilangnya fasa diam ini, maka fasa diam diikat secara kovalen pada partikel silica. Ikatan fasa diam diperoleh dengan mereaksikan partikel silica dengan organochlorosilane dengan bentuk Si (CH3)2RCl dimana R adalah alkil atau alkil yang tersubstitusi.
Nah, kolom juga bisa rusak lho bila tidak dirawat dengan benar. Bagaimana kita tahu kolom tersebut rusak? Bila kromatogram yang dihasilkan terpecah (tidak runcing), ataupun ada pengotor lain yang biasanya datang dari fasa gerak yang mengganggu peak utama.
Olehkarena itu kita harus hati-hati dalam pembersihannya setelah digunakan ataupun saat penyimpanan. Setelah selesai digunakan, kolom harus selalu dicuci. Larutan asam, basa atau garam tidak boleh dibiarkan berada dalam kolom.
Bagaimana ya cara penyimpanan kolom HPLC?
Apabila sedang tidak digunakan kolom direndam dalam pelarut inert yang tidak mudah menguap (metanol, metanol-air, air suling). Direndam disini maksudnya dialiri oleh pelarut inert tersebut selama beberapa waktu, kemudian dilepas setelah selesai. Pelarut tersebut dibiarkan di dalam fasa gerak selama penyimpanan. Kolom dapat disimpan dalam pelarut organik yang tidak mudah menguap atau dalam air. Umumnya jenis pelarut yang digunakan harus disesuaikan dengan jenis kolomnya. Sebagai contoh :
1. Kolom penukar ion disimpan dalam metanol atau air. Metanol lebih disukai karena dapat mencegah pertumbuhan bakteri.
2. Kolom fasa terikat tak polar disimpan dalam metanol. Asetonitril tidak dianjurkan untuk dipakai di sini karena selain harganya mahal, asetonitril ini dapat terurai membentuk pengotor pada kolom.
3. Kolom fasa terikat polar disimpan dalam heptana atau metanol.
4. Kolom silika disimpan dalam heptana.
Karena kolom fasa terikat polar dapat disimpan baik dalam pelarut tak polar ataupun dalam pelarut polar, maka dianjurkan agar di dalam penyimpanannya dipilih jenis pelarut yang mempunyai kepolaran yang hampir sama dengan kepolaran pelarut yang akan digunakan sebagai eluen.
