Kegiatan untuk Mengurutkan Genom Semua Hal

Entomolog Benjamin Wiesmair [di sebelah kanan] menggunakan ponselnya untuk mengakses basis data lepidoptera guna mengidentifikasi spesies ngengat yang ditangkap selama sesi perangkap di jalur alpine di atas Malles Venosta, Italia. Clara Spilker dan Alena Sucháčková [tengah] merujuk pada tabel untuk menentukan apakah spesies tersebut diperlukan untuk penyequensian genom.

Eukariota adalahorganisme yang sel-selnya mengandung inti. Dari protozoa hingga manusia, semuanya memiliki mekanisme biologis dasar yang sama untuk membangun, memelihara, dan menyebarluaskan bentuk kehidupan mereka: genom. Itu adalah total keseluruhan gen yang dibawa oleh makhluk tersebut.

Dua puluh dua tahun yang lalu, para peneliti mengumumkan bahwa untuk pertama kalinya mereka telah memetakan, atau “mengurutkan,” hampir seluruh gen dalam sebuahgenom manusiaBiaya proyeklebih dari 3 miliar dolar ASdan memakan waktu 13 tahun, tetapi pada akhirnya mengubah praktik kedokteran. Dalam era baru dariMedisin genomik, dokter dapat mempertimbangkan susunan genetik spesifik pasien selama diagnosis dan pengobatan.

Banyak kupu-kupu, yang tertarik pada cahaya ultraviolet, ditangkap selama ekspedisi penangkapan dengan cahaya di dekat Malles Venosta, Italia.

EBP bertujuan mencapai tujuan monumentalnya pada tahun 2035. Sejak Juli 2024, jumlah genom yang telah diurutkan adalahsekitar 4.200. Keberhasilan pasti akan bergantung pada kemampuan para peneliti untuk memperbesar beberapa teknologi bioteknologi.

“Kami perlu meningkatkan, dari posisi kami saat ini, lebih dari seratus kali lipat dalam hal jumlah genom per tahun yang kami hasilkan di seluruh dunia,” kataHarris Lewin, yang memimpin EBP dan adalah profesor serta peneliti genetika diUniversitas Negara Arizona.

Salah satu teknologi paling penting yang harus dikembangkan adalah teknik yang disebut sekuensing genom bacaan panjang. Para ahli di garis depan revolusi genomik dalam biologi yakin bahwa pengembangan ini akan mungkin, keyakinan mereka sebagian berasal dari pengalaman masa lalu. “Dibandingkan tahun 2001,” ketika Proyek Genom Manusia mendekati penyelesaian, “sekarang biaya untuk mengurutkan DNA sekitar 500.000 kali lebih murah,” kataSteven Salzberg, seorang Distinguished Professor di Bloomberg atUniversitas Johns Hopkinsdan direktur sekolah iniPusat Biologi Komputasi. “Dan ini juga sekitar 500.000 kali lebih cepat dalam sekuen,” tambahnya. “Itu adalah skala, selama 25 tahun terakhir, skala percepatan yang jauh melampaui peningkatan dalam teknologi komputasi, baik dalam memori maupun kecepatan prosesor.”

Seorang lepidopteris menulis informasi identifikasi pada label yang ditempelkan pada wadah sampel yang berisi ngengat yang ditangkap selama ekspedisi penangkapan cahaya di dekat Malles Venosta, Italia.

Ada banyak alasan untuk bersorak bagi EBP dan kemajuan teknologi yang akan mendukungnya. Dengan telah menetapkan genom untuk setiap makhluk eukariotik, para peneliti akan memperoleh wawasan mendalam baru mengenai hubungan antara benang-benang dalam jaring kehidupan Bumi, serta bagaimana evolusi berlangsung bagi berbagai bentuk kehidupan. Pengetahuan ini akan semakin penting seiring perubahan iklim yang mengubah ekosistem yang menjadi dasar bagi semua makhluk tersebut, termasuk kita sendiri.

Dan meskipun proyek tersebut adalah kolaborasi ilmiah, itu bisa menghasilkan keuntungan finansial yang besar. Banyak obat, enzim, katalis, dan bahan kimia lainnya yang bernilai tak ternilai pertama kalidikenali dalam sampel alamiPara peneliti mengharapkan banyak lagi yang akan ditemukan dalam proses mengidentifikasi, pada dasarnya, masing-masing dari miliaran gen eukariotik di Bumi, banyak di antaranya mengkode protein dalam bentuk apa pun.

“Satu ide adalah dengan melihat tanaman, yang memiliki berbagai macam bahan kimia, seringkali yang mereka buat untuk melawan serangga atau hama, kita mungkin bisa menemukan molekul baru yang akan menjadi obat yang penting,” kataRichard Durbin, profesor genetika diUniversitas Cambridgedan seorang veteran dari beberapa inisiatif penyequensian genom. Obat imunosupresan dan kankerrapamisin, untuk menyebut satu contoh dari ratusan contoh yang ada, berasal dari genom mikroba.

Gen Anda adalah Alasan Besar Mengapa Anda Adalah Anda

EBP adalah organisasi payung untuk beberapa60 proyek(dan terus bertambah) yang sedang melakukan penyequensian spesies baik di suatu wilayah maupun dalam kelompok taksonomi tertentu. Sang overachiever adalahProyek Pohon Kehidupan Darwin, yang mengurutkan semua spesies di Britania Raya dan Irlandia, dan telah berkontribusi sekitar setengah dari seluruh genom yang tercatat oleh EBP hingga saat ini. Proyek Psyche dilahirkan dari inisiatif Darwin Tree of Life, dan keduanya telah menerima dukungan yang generos dari theTrust Wellcome.

Untuk mendapatkan gambaran tentang besarnya EBP (Genom Lepidoptera), pertimbangkan apa yang diperlukan untuk melakukan sekuensing spesies. Pertama, sebuah organisme harus ditemukan atau ditangkap dan diambil sampelnya, tentu saja. Itulah yang membawa Wiesmair, Spilker, dan 41 lepidopteris lainnya ke Pegunungan Alpen Italia untuk ekspedisi Project Psyche pada bulan Juli lalu. Dalam lima hari, mereka mengumpulkan lebih dari 200 spesies baru untuk sekuensing, yang akan menambah 1.000 urutan genom lepidoptera yang telah selesai dan sekitar 2.000 sampel yang menunggu sekuensing. Masih banyak pekerjaan yang harus dilakukan; terdapat sekitar 11.000 spesies ngengat dan kupu-kupu di seluruh Eropa dan Britania.

Setelah pengambilan sampel, materi genetik—DNA makhluk tersebut—dikumpulkan dari sel-sel dan kemudian dipecah menjadi fragmen yang cukup pendek untuk dibaca oleh mesin sekuensing. Setelah sekuensing, data genom dianalisis untuk menentukan di mana gen-gen itu berada dan, jika memungkinkan, apa fungsinya.

Dalam 25 tahun terakhir, percepatan teknologi penentuan urutan gen telah jauh melampaui peningkatan apa pun dalam teknologi komputasi, baik dalam memori maupun kecepatan prosesor.

DNA adalah molekul yang strukturnya terkenalheliks ganda. Ia berada di inti setiap sel dalam tubuh semua makhluk hidup. Jika Anda memikirkan molekul sebagai tangga yang melengkung, anak tangganya dibentuk oleh pasangan unit kimia yang disebut basa. Ada empat basa yang berbeda: adenin (A), guanin (G), sitosin (C), dan timin (T). Adenin selalu berpasangan dengan timin, dan guanin selalu berpasangan dengan sitosin. Jadi, sebuah “anak tangga” bisa berupa salah satu dari empat kemungkinan: A-T, T-A, C-G, atau G-C.

Empat yang itupasangan basispermutasi adalah simbol-simbol yang menyusun kode kehidupan. String-stringnya membentuk genom sebagai segmen-segmen dengan berbagai panjang yang disebutgenetikaGenetik Anda setidaknya sebagian mengontrol sebagian besar ciri fisik dan banyak ciri mental Anda—bukan hanya warna mata Anda dan tinggi badan Anda, tetapi juga penyakit apa yang Anda rentan, seberapa sulit bagi Anda untuk membangun otot atau menurunkan berat badan, bahkan apakah Anda rentan terhadap mabuk perahu.

Cara Kerja Sekuensing Genom Bacaan Panjang

Sequencing bacaan panjang dimulai dengan memecah sampel materi genetik menjadi potongan yang biasanya sepanjang sekitar 20.000 pasang basa. Kemudian teknologi sequencing membaca urutan pasangan basa pada untai DNA tersebut untuk menghasilkan segmen acak, yang disebut “bacaan”, dari DNA yang panjangnya minimal 10.000 pasang. Setelah bacaan panjang tersebut diperoleh, perangkat lunak bioinformatika yang kuat digunakan untukbangun rentang yang lebih panjangdari urutan yang berurutan dengan bacaan yang tumpang tindih yang memiliki urutan basis yang sama.

Untuk memahami prosesnya, bayangkan genom sebagai sebuah novel, dan masing-masing bagian yang terpisahkromosomsebagai sebuah bab dalam novel. Bayangkan menghancurkan novel tersebut menjadi potongan kertas, masing-masing sekitar 5 sentimeter persegi. Tugas Anda adalah menyusun ulangnya menjadi novel aslinya (sayangnya bagi Anda, halaman-halaman tersebut tidak diberi nomor). Yang membuat tugas ini mungkin adalah tumpang tindih—Anda menghancurkan beberapa salinan novel, dan potongan-potongan tersebut tumpang tindih, sehingga lebih mudah untuk melihat di mana satu bagian berakhir dan bagian lain dimulai.

Yang membuatnya jauh lebih sulit, adalah banyak bagian buku yang penuh dengan kekacauan yang berulang: kata yang sama diulang ratusan bahkan ribuan kali. Setidaknya separuh dari genom mamalia biasanya terdiri dari urutan berulang ini, beberapa di antaranya memilikifungsi regulasidan yang lainnya dianggap sebagai”DNA” sampahyang berasal dari gen-gen kuno atau infeksi virus dan tidak lagi berfungsi. Teknologi bacaan panjang sangat mahir dalam menangani urutan repetitif ini. Kembali ke analogi penghancuran buku yang baru, bayangkan mencoba menyusun ulang buku tersebut setelah dihancurkan menjadi potongan-potongan berukuran 1 sentimeter persegi daripada 5. Itu analog dengan tantangan yang sebelumnya dihadapi para peneliti saat mencoba menyusun urutan DNA jutaan pasangan basa menggunakan teknologi lama,teknologi sekuensing “short-read”.

Dua Pendekatan dalam Sekuensing Bacaan Panjang

Pasaran sekuen membaca panjang memiliki dua perusahaan terkemuka—Oxford Nanopore Technologies(ONT) danPacific Biosciences of California(PacBio) – yang bersaing secara intensif. Dua perusahaan ini telah mengembangkan sistem yang sama sekali berbeda.

Jantung dariSistem ONTadalah sel alir yang mengandung 2.000 atau lebih lubang sangat kecil yang disebut, cukup tepat, nanopori. Nanopori ini diikat dalam membran yang tahan listrik, yang terintegrasi pada chip sensor. Dalam operasinya, masing-masing ujung segmen DNA dihubungkan dengan molekul yang disebut adapter yang mengandung sebuahenzim helikase. Tegangan diberikan melalui nanopore untuk menciptakan medan listrik, dan medan tersebut menangkap DNA yang memiliki adapter yang terikat. Helikase mulai membuka DNA berpita ganda, dengan salah satu rantai DNA melewati nanopore, basa per basa, sementara yang lain dilepaskan ke dalam medium.

SEKUENSING OPTIK (Pacific Biosciences)

Enzim polimerase mereplikasi rantai DNA, memasangkan dan menghubungkan setiap basa dengan nukleotida yang dirancang khusus, yang komplementer. Nukleotida tersebut bercahaya dalam warna karakteristik yang mengidentifikasi basa mana yang sedang dihubungkan.

Setiap rantai DNA diikat di dasar suatu lubang.

Saat rantai DNA direplikasi, setiap basa yang terbentuk memancarkan cahaya kecil berwarna yang khas untuk basa tersebut. Urutan cahaya yang muncul menunjukkan urutan basa.

Apa yang mendorong benang melalui nanopori adalah tegangan itu—hanya sekitar 0,2 volt, tetapi nanopori hanya lebarnya 5 nanometer, sehingga medan listriknya mencapai ratusan ribu volt per meter. “Ini seperti kilat yang melewati pori,” kataDavid Deamer, salah satu penemu teknologi tersebut. “Awalnya, kami takut DNA-nya akan terbakar, tetapi ternyata air di sekitarnya menyerap panasnya.”

Kekuatan medan semacam itu biasanya mendorong molekul berbasis DNA melewati pori dengan kecepatan yang terlalu cepat untuk dianalisis. Namun, helikase bertindak seperti pengereman, menyebabkan molekul tersebut melewati pori dengan gerakan seperti engkol, satu basa demi satu basa, dengan kecepatan yang masih cukup tinggi sekitar 400 basa per detik. Di sisi lain, medan listrik juga mendorong aliran ion melintasi nanopori. Aliran arus ini berkurang akibat adanya basa di dalam nanopori—dan secara krusial, besarnya penurunan ini bergantung pada basa mana dari empat basa, A, T, G, atau C, yang masuk ke dalam pori. Hasilnya adalah sinyal listrik yang dapat dengan cepat diterjemahkan menjadi urutan basa.

SEKUENSING NANOPORE (Oxford Nanopore)

Enzim helikase membuka dan merentangkan DNA berpita ganda, dan satu rantai masuk ke dalam nanopori. Enzim tersebut memasukkan rantai tersebut melalui nanopori dengan gerakan seperti engkol, satu basa demi satu basa.

Arus ionik berkurang sebesar jumlah tertentu, tergantung pada basa. Sinyal arus menunjukkan urutan basa.

Mesin PacBio bergantung pada cara optik daripada cara elektronik untuk mengidentifikasi basa.Proses terbaru PacBioyang disebut HiFi, dimulai dengan menutup kedua ujung segmen DNA dan membuka helainya untuk menciptakan loop tunggal. Setiap loop kemudian ditempatkan dalam lubang yang sangat kecil pada sebuah mikrochip, yang dapat memiliki 25 juta lubang semacam itu. Setiap loop memiliki enzim polymerase yang memainkan fungsi penting setiap kali sel membelah. Enzim ini melekat pada DNA tunggal dan menambahkan basa komplementer, membuat setiap bilah tangga kembali utuh. PacBio menggunakan versi khusus dari empat basa yang telah diubah agar bercahaya dalam warna karakteristik ketika terkena cahaya ultraviolet.

Laser UV menyinari melalui dasar lubang kecil tersebut, dan sensor foto di bagian atas mendeteksi kilauan cahaya yang lemah saat polimerase berputar mengelilingi loop sampel DNA, satu basa demi satu basa. Akibatnya, terdapat rangkaian kilauan cahaya dengan laju sekitar tiga per detik yang mengungkap urutan pasangan basa dalam sampel DNA.

Karena sampel DNA telah diubah menjadi lingkaran, seluruh proses dapat diulang untuk mencapai akurasi yang lebih tinggi, dengan hanya mengikuti lingkaran tersebut sekali lagi. Mesin utama PacBio, Revio, biasanya melakukan lima hingga sepuluh kali lalu lintas, mencapai tingkat akurasi median hingga 99,9 persen, menurutAaron Wenger, direktur senior pemasaran produk di perusahaan.

Bagaimana Peneliti akan Memperbesar Sekuensing Bacaan Panjang

Akurasi jenis itu tidak murah.Sistem Revioyang memiliki empat chip, masing-masing dengan 25 juta lubang, sekitar $600.000 menurut Wenger. Beratnya 465 kilogram dan ukurannya sebesar kulkas rumah tangga besar. PacBio mengatakan satu Revio dapat melakukan sekuensing sekitar empat genom manusia utuh dalam periode 24 jam dengan biaya kurang dari $1.000 per genom.

ONT mengklaim akurasi di atas 99 persen untuk mesin andalannya, yang disebutPromethION 24. Biayanya sekitar 300.000 dolar, menurutRosemary Sinclair Dokos, chief product dan marketing officer di ONT. Keuntungan lain dari sistem ONT PromethION adalah kemampuannya memproses fragmen DNA dengan sebanyak satu juta pasangan basa. ONT juga menawarkan sistem level pemula, yang disebutMinION Mk1D, hanya dengan $3.000. Ukurannya sekitar dua ponsel yang ditumpuk satu sama lain, dan dapat dihubungkan ke laptop, menawarkan peneliti suatu perangkat yang dapat dengan mudah dibawa ke lapangan.

Di Centro Nacional de Análisis Genómico, di Barcelona, teknisi Álvaro Carreras menyiapkan mesin sekuensing bacaan panjang PromethION, dari Oxford Nanopore Technologies, untuk mengurutkan genom. Di belakang Carreras adalah mesin bacaan panjang Pacific Biosciences Revio.

Meskipun para peneliti sering memiliki preferensi yang kuat, tidak jarang sebuah laboratorium genetika terkini dilengkapi dengan mesin dari kedua perusahaan tersebut. Misalnya, di Centro Nacional de Análisis Genómico di Barcelona, para peneliti memiliki akses ke mesin PacBio Revio serta mesin PromethION 24 dan GridION dari ONT.

Durbin, di Universitas Cambridge, melihat banyak keuntungan dalam situasi saat ini. “Sangat baik memiliki dua perusahaan,” katanya. “Mereka bersaing satu sama lain untuk pasar.” Dan persaingan ini pasti akan mendorong kemajuan teknologi yang diharapkan pendukung EBP untuk mengantarkan proyek ini hingga selesai.

Seorang teknisi di Centro Nacional de Análisis Genómico, di Barcelona, memegang sel alir untuk mesin sekuensing panjang-read PromethION dari Oxford Nanopore Technologies. Sel alir ini mengandung sebuah chip yang berinteraksi dengan sampel DNA untuk melakukan sekuensing panjang-read.

Wenger dari PacBio mencatat bahwa chip 25 juta lubang yang menjadi dasar sistem Revio-nya masih diproduksi pada wafer semikonduktor berukuran 200 milimeter. Perpindahan ke wafer berukuran 300 mm dan teknik litografi yang lebih canggih, katanya, akan memungkinkan mereka mendapatkan banyak chip per wafer dan menempatkan ratusan juta lubang di masing-masing chip tersebut—jika permintaan pasar menginginkannya.

Di ONT, Dokos menjelaskan matematika yang serupa. Satu sel aliran sekarang terdiri dari lebih dari 2.000 nanopori, dan sistem PromethION 24 yang terkini dapat memiliki 24 sel aliran (atau lebih dari 48.000 nanopori) yang berjalan secara paralel. Namun, sebuah sistem masa depan bisa memiliki ratusan ribu nanopori, katanya—lagi-lagi, jika pasar menginginkannya.

EBP akan membutuhkan semua kemajuan tersebut, dan lebih banyak lagi. Direktur EBP Lewin mencatat bahwa setelah tujuh tahun,inisiatif tiga fasesedang menyelesaikan tahap pertama dan bersiap untuk tahap kedua. Tujuan tahap kedua adalah mengurutkan 150.000 genom antara tahun 2026 dan 2030. Untuk tahap kedua, “Kita harus mencapai 37.500 genom per tahun,” kata Lewin. “Saat ini, kita hampir mencapai 3.000 per tahun.” Dalam tahap kedua, biaya per genom yang diurutkan juga harus turun dari sekitar $26.000 per genom dalam tahap pertama menjadi $6.100, menurut para ahli.Peta jalan resmi EBPAngka $6.100 ini mencakup semua biaya—bukan hanya sekuen, tetapi juga pengambilan sampel dan tahap-tahap lain yang diperlukan untuk menghasilkan genom yang selesai, dengan semua gen yang diidentifikasi dan ditetapkan pada kromosom.

Seorang teknisi di Centro Nacional de Análisis Genómico, di Barcelona, memasukkan sampel DNA yang terpecah untuk sekuensing dalam mesin PromethION dari Oxford Nanopore Technologies.